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恐艾必读:检测和临床意义

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发表于 2018-11-22 10:34:34 | 显示全部楼层 |阅读模式
       HIV感染的实验室检测在HIV感染的诊断、疾病进展的监测、抗病毒疗效观察和耐药性监测中至关重要。但HIV检测不同于其它病原微生物检测,要求十分严格,任何错误的诊断,包括假阳性或假阴性,都会对被检者产生十分重要的影响。因此,HIV检测必须严格按照国家制定的《艾滋病检测工作管理办法》和《艾滋病检测技术规范》(以下简称《规范》)进行。

       HIV感染的诊断

       1.HIV抗体检测

       目前国外用于HIV抗体筛查的方法很多,根据检测原理不同分为酶联免疫吸附法、凝集法和免疫层析法,可对血液、唾液和尿液标本进行常规或快速检测。在实际工作中常用的有酶联免疫吸附试验(ELISA)、明胶凝集试验和各种快速诊断试剂。自1985年第一代ELISA试剂问世以来,随着医学技术的飞速发展,包被抗原已从第一代的全病毒裂解物发展为目前以基因重组与多肽抗原包被和标记的有着良好敏感性和特异性的第三代双抗原夹心试剂,检测亚型包括HIV-1、HIV-2和HIV-1型的O亚型,窗口期由10周缩短至3~4周。为避免窗口期传染,荷兰、法国等国已研制出可同时检测抗原抗体的第四代ELISA筛查试剂,但其临床价值有待评估。按《规范》要求,我国采供血机构进行血液筛查和各医疗卫生机构常规筛查检测宜采用ELISA法,自采自供血的单位必须进行HIV抗体检测,在尚未建立艾滋病筛查实验室的偏远地区或大医院急诊手术前可由经过培训的技术人员在规定的场所用快速检测试剂进行血液筛查。对用ELISA试剂或快速诊断试剂进行的筛查实验如呈阴性反应,即报告HIV抗体阴性;对呈阳性反应的标本,筛查实验室应用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的试剂进行重复检测,如两种试剂复测均呈阴性反应,则报告HIV抗体阴性;如均呈阳性反应,或一阴一阳,需送艾滋病确认实验室进行确认。筛查试剂必须是HIV-1/2混合型、经国家药品监督管理局(SDA)注册批准、批检合格、临床评估质量优良、在有效期内的试剂。

       HIV抗体筛查呈阳性反应的标本由于存在假阳性的可能,必须做确认试验。国际上有3种确认试验方法,包括免疫印迹试验、条带免疫试验及免疫荧光试验,目前以免疫印迹试验最为常用。确认试剂必须经SDA注册批准。免疫印迹试剂有HIV-1/2混合型和单一型,按《规范》要求,一般先用HIV-1/2混合型试剂进行检测,根据《规范》中判定免疫印迹试验结果的基本原则并参照所用试剂说明书综合判定:无HIV抗体特异带出现的报告HIV抗体阴性;出现HIV抗体特异带,符合HIV-1抗体阳性判定标准,则报告HIV-1抗体阳性。如出现HIV-2型的特异性条带,需用HIV-2型免疫印迹试剂再做单一的HIV-2型抗体确认试验,呈阴性反应,报告HIV-2抗体阴性;呈阳性反应的则报告HIV-2抗体血清学阳性,如需鉴别应进行核酸序列分析。如果出现HIV抗体特异带,但带型不足以判定为阳性,则判为HIV抗体不确定。对HIV抗体不确定者应按《规范》要求进行随访,必要时可做HIV-1 P24抗原或核酸测定,但检测结果只能作为辅助诊断依据,确认报告要依据血清学随访结果。由于目前唾液检测试剂的敏感性和尿液检测试剂的特异性明显低于血液检测试剂,故我国SDA已注册批准的HIV抗体筛查和确认试剂只能用于血液标本检测。

       目前抗体确认试验阳性是我国HIV感染诊断标准中不可缺少的,不能仅凭临床表现判定是否为HIV感染或艾滋病。

       2.P24抗原和HIV核酸检测

       HIV感染人体后有一段窗口期,目前用于HIV抗体检测的第三代ELISA试剂窗口期为3~4周,在该期病毒抗体不能被检出,但可检测到病毒相关抗原或分离出病毒,故在窗口期检测P24抗原是早期辅助诊断和进一步缩短窗口期的一种方法,还可用于HIV阳性母亲所生婴儿的早期辅助鉴别诊断。HIV-1 P24抗原检测一般用ELISA双抗体夹心法试剂(经SDA批准注册),阳性结果必须经中和试验确认,该结果才可作为HIV感染的辅助诊断依据。HIV-1 P24抗原检测阴性,只表示在本试验中无反应,不能排除HIV感染。

       HIV核酸检测,通常是检测HIV RNA,以前只能定性检测血液中是否存在病毒核酸,而目前的技术可定量检测血液中病毒复制水平。HIV核酸定性检测可用于HIV感染的辅助诊断,通常使用PCR或RT-PCR技术,使用分子生物学实验室通用的扩增试剂,引物可来自文献或自行设计,应尽量覆盖所有或常见的毒株,也可使用复合引物。值得注意的是, HIV核酸定性检测阴性,只可报告本次实验结果阴性,但不能排除HIV感染;HIV核酸检测阳性,可作为诊断HIV感染的辅助指标,不能单独用于HIV感染的诊断,报告定性检测结果时还应注明反应条件和所使用的引物序列。报告HIV核酸定量检测结果时应按照仪器读数报告结果,注明使用的试验方法、样品种类和样品量,当测定结果小于最低检测限时,应注明最低检测限水平,低于最低检测限的结果不能排除HIV感染。

       疾病进展的实验室监测

       在HIV感染中,CD4+T淋巴细胞计数及血浆HIV RNA水平(病毒载量)可以为临床医生提供病人病毒水平、免疫状态的相关资料,是预测疾病进程的可靠指标。这两项实验还可独立预测艾滋病临床过程和生存期。

       流式细胞仪是检测CD4+T淋巴细胞计数的标准方法,可以得出CD4+T细胞占淋巴细胞的比值及绝对值。CD4+T细胞计数是艾滋病诊断、疾病分期的实验室标准指标(表1)。用于病毒载量的检测方法有逆转录PCR、核酸序列扩增实验(NASBA)、分支DNA杂交实验(bDNA)等,其结果多用于监测HIV感染者的病程进展和抗病毒治疗效果。对于未进行抗病毒治疗的HIV感染者,最好在诊断为HIV感染时检测CD4+T淋巴细胞绝对值及病毒载量,以后每3~6个月检查CD4+T细胞计数,每3~4个月检测病毒载量,以利于临床医生及时掌握HIV感染者和艾滋病人的疾病进展情况。值得注意的是,由于不同的血浆病毒载量检测方法结果有所差异,故在对同一病人进行疾病进展观察及疗效评估时,最好在同一实验室应用同样的检测方法以利于对检测结果的分析。

       抗病毒治疗的疗效观察

       1.治疗时机

       在CDC于 2002年制定的《艾滋病诊断与治疗指导方案》(以下简称《方案》)试行版中明确规定,对急性感染期病人HIV血清阳转6个月之内和所有出现艾滋病临床症状的患者应给予抗病毒治疗。对于无症状期感染者,其抗病毒治疗时机须参照CD4+T细胞计数及病毒载量综合判定(表2)。

       2.评价治疗效果

       成功的抗病毒治疗应该达到以下效果:血浆中HIV-RNA的水平4周内应下降1个Log以上, 4~6个月内病毒降至检测不到的水平(HIV RNA<50拷贝/ml),CD4+T淋巴细胞计数应逐渐上升。如果达不到相应指标,则应根据实验室检测结果调整治疗方案。

       3.调整用药依据

       为了保证抗病毒治疗的效果,延缓耐药性产生,在进行抗HIV治疗时,应定期进行CD4+T细胞计数及病毒载量检测。《方案》中规定,如出现下列情况则应调整用药:①经HAART治疗8周后,血浆中病毒载量比原水平降低没有超过1.0 log;②经HAART治疗6个月后,血浆中病毒载量没有降至"测不出"的水平(<50拷贝数/ml);③血浆中病毒载量经HAART治疗已达到"测不出"的水平后又出现上升,提示出现了耐药;④除外并发感染、疫苗接种、检测方法的改变,血浆病毒载量从最低点上升3倍或更高;⑤CD4+T细胞持续性减少并出现临床恶化。

       抗病毒治疗的耐药监测

       随着我国抗HIV治疗的开展,耐药性的监测越来越受到重视。HIV病毒耐药分为原发性(Primary)及继发性(Secondary)两种,前者指那些直接影响抗病毒药物作用靶点的变异,具有药物特异性,可降低抗病毒药物敏感性;继发性变异又称为补偿变异,常出现于原发性变异已存在的病毒基因组中,原发性变异可造成复制关键酶的改变,导致病毒动力学的不利,继发性变异可纠正由原发性变异导致的不利,提高病毒的耐药性,对原发性变异起到保护和促进作用[2]。在HAART治疗中,病毒变异使得治疗的敏感性下降,常常导致治疗失败。

       目前耐药性检测有两种方法,即表型检测及基因型检测。表型检测通过用药期间的病毒培养进行,而基因型检测则通过分子生物学方法检测与耐药性相关的病毒基因突变。基因型检测的费用较低,技术也相对容易,可在样品收集后1~2周得到结果,但分析基因型耐药检测时,需要掌握大量相关知识,如突变与抗病毒药物及其它药物的交叉耐药等,才能对结果进行正确的分析。表型检测可以直接检测病毒的耐药性,但*作复杂、耗时,技术要求高,且非常昂贵,因此目前国际上广泛应用于临床的是基因型耐药检测。

       美国和西欧的研究报道,约5~16%的新感染者为HIV-1耐药株感染[3]。徐军强等对16例我国HIV感染者进行基因型耐药变异检测,仅发现1例在HAART治疗前存在原发性耐药变异[4],我们实验室对10例治疗前的我国HIV/AIDS患者进行耐药检测,未发现原发性变异,有3例存在蛋白酶区继发性变异,提示我国绝大多数HIV/AIDS患者对HAART治疗效果应该是敏感的。临床医生应规范治疗,及时检测CD4+T细胞及病毒载量变化。

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